荧光定量PCR是在PCR反应体系中加入荧光染料(SYBR Green)或带荧光基团的特异性探针,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,结合相应的软件可以对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度。可以用于检测mRNA/lncRNA/circRNA的基因表达水平。每个样本默认做3个复孔的技术重复。
实验流程:
RNA提取-逆转录成cDNA-qPCR扩增-数据分析-发实验结果
样本要求及运输条件:
1、组织样本:
(1)动物组织:尽可能新鲜和足量的组织(>50-100mg,至少绿豆大小),保存于-80℃或者液氮。
(2)植物组织:新鲜的叶、果肉、种子最少100mg,保存于-80℃或者液氮。
2、细胞样本:
细胞量要求:每个实验组细胞数量保证大于106以上;6孔板70-80%;T25培养瓶70-80%。若检测指标较多,需适当增加样本量。
3、全血:EDTA抗凝管收集1毫升新鲜血液,-80℃保存,干冰运输。
4、血清或血浆:1毫升以上,-80℃保存,干冰运输。
5、RNA样本:OD 260/280为1.8-2.0,浓度为100ng/μL,-80℃保存,干冰运输。
6、cDNA:cDNA原液提供200μL以上,-80℃保存,干冰运输。