EDU(5-ethynyl-2'-deoxyuridine,5-乙炔基-2'脱氧尿嘧啶核苷)是一种胸腺嘧啶核苷类似物,其乙炔基团在天然化合物中很少见,在细胞增殖时能够插入正在复制的DNA分子中,基于EdU与染料的共轭反应可以高效快速地检测细胞增殖,可以有效地检测处于S期的细胞百分数。
主要用途:
EdU只有BrdU抗体大小的1/500,在细胞内更容易扩散,不需要严格的样本变性处理,有效地避免了样本损伤,有助于在组织、器官的整体水平上观测细胞增殖的真实情况,具有更高的灵敏度和更快的检测速度。适用于细胞增殖、细胞分化、生长与发育、DNA修复、病毒复制、细胞标记示踪等方面。
检测原理:
在DNA合成过程中,EdU可取代脱氧胸腺嘧啶核苷(T),插入DNA链中。另一方面,标记的小分子叠氮化物探针通过一价铜离子的催化发生共价反应,形成稳定的三唑环,反应非常迅速,且合成的DNA会被相应的荧光探针所标记,从而可以用适当的荧光检测设备检测到增殖的细胞。
实验流程:
细胞培养-用EdU孵育样本-细胞固定-EdU检测-DAPI染核-封片-显微镜镜检。
样本要求及运输条件:
1、提供固定完全的组织样本。组织离体后,选择合适的固定液和容器立即固定,固定液的量建议大于组织体积的10-15倍,固定时间建议24-48h,大标本固定12h,再切开固定。固定完全后尽快送检。标本常温(24℃左右)或冷藏(4℃)固定,切勿冷冻结冰,固定样本常温运输送样。样本需经EdU处理。
2、爬片必须充分固定,4℃保存运输,样本需要经EdU孵育处理。
注意事项:
1、建议使用50μM EdU培养基孵育,但可以在预实验时根据细胞类型和实验目的,以一系列浓度(10-100μM)的EdU培养基孵育进行优化,细胞不能太密,一般60%-70%。
2、不同细胞类型之间有一定差异,可以先做一个时间梯度,找出合适的孵育时间。
3、EdU孵育时间>24小时宜采用较低浓度,而EdU孵育时间<45分钟宜采用较高浓度。
4、固定好的细胞不染色,于4℃可存放约1个月。组织切片如暂不检测就不脱蜡。